Resumen La producción pesquera puede generar cantidades considerables de residuos cuya disposición final inadecuada puede causar daños ambientales. La utilización de estos desechos para la obtención de productos con alto valor agregado y de interés industrial, es una alternativa para la producción acuícola sostenible. En este trabajo se obtuvieron y caracterizaron extractos ácidos ricos en enzimas tipo pepsina (EP) y alcalinos ricos en enzimas tipo tripsina (ET) a partir de vísceras de pacú (Piaractus mesopotamicus) evaluando sus potenciales aplicaciones biotecnológicas. EP y ET exhibieron máxima actividad catalítica a pH 2 - 45°C y pH 7 - 45°C; mostraron ser estables en los rangos de pH 1,0 a 3,5 y 7,5 a 10,5 y de temperatura 0 a 37°C y 0 a 45°C, respectivamente. La actividad de EP fue inhibida por pepstatina A pero no por PMSF y SBTI; EDTA y SDS provocaron inhibición parcial, confirmando la presencia de enzimas de tipo pepsina. ET se inactivó en presencia de SBTI pero no por SDS; PMSF y EDTA disminuyeron en un 50% su actividad, confirmando la existencia de enzimas tipo tripsina. Los iones divalentes (Ca2+ y Mg2+) no modificaron la capacidad proteolítica de los extractos, en cambio se redujo a concentraciones crecientes de NaCl. Por otra parte, ET y EP fueron eficaces para hidrolizar el recubrimiento de gelatina impregnado con plata de placas radiográficas usadas y generar fragmentos F(ab’)2 a partir de la degradación de IgG equinas, respectivamente. En conclusión, estos extractos podrían ser aplicables en procesos donde se requiera máxima actividad a temperatura moderada y baja concentración de NaCl; en la recuperación de plata metálica y celuloide de placas radiográficas reveladas como así también la obtención de productos biológicos. Estos resultados abren nuevas perspectivas para la economía circular de las explotaciones acuícolas del pacú.

Abstract Fish production can generate considerable amounts of waste, whose inadequate final disposition could cause environmental damage. The use of these wastes to obtain high value-added products of industrial relevance is an alternative for sustainable aquaculture production. In this study, acidic extracts rich in pepsin-like enzymes (EP) and alkaline extracts rich in trypsin-like enzymes (ET) were obtained and characterized from the viscera of pacu (Piaractus mesopotamicus), evaluating their potential biotechnological applications. EP and ET showed maximum catalytic activity at pH 2 - 45°C and pH 7 - 45°C, respectively. They were stable in pH ranges of 1.0 to 3.5 and 7.5 to 10.5 and temperature ranges of 0 to 37°C and 0 to 45°C, respectively. The activity of EP was inhibited by pepstatin A, but not by PMSF and SBTI. EDTA and SDS caused partial inhibition, confirming the presence of pepsin-like enzymes. ET was inactivated in the presence of SBTI but not by SDS. PMSF and EDTA decreased the activity by 50%, confirming the presence of trypsin-like enzymes. Divalent ions (Ca2+ and Mg2+) did not alter the proteolytic capacity of the extracts, but it decreased with increasing NaCl concentration. Moreover, ET and EP were effective in hydrolyzing the silver-impregnated gelatin coating of discarded x-ray films and generating F(ab')2 fragments from equine IgG degradation, respectively. In conclusion, these extracts could be applicable in processes requiring maximum activity at moderate temperatures and low NaCl concentrations, in the recovery of metallic silver and PET sheet from used x-ray films and in the production of biological products. These results open up new perspectives for the circular economy of pacú aquaculture farms.

In this work we study the effects caused by the venom of Bothrops diporus on the dense vascular network that supplies the equine foot. In order to analyze the in vitro effects, samples of the knee area of five horse hoofs were incubated in DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium) plus 50 ug snake venom in cell culture plates. Samples incubated with DMEM and without venom were considered as controls. All the samples were incubated at 37 °C in a 5% carbon dioxide atmosphere, 95% humidity during 24 and 48 hours. After incubation samples were fixed in buffered formaldehyde and processed according to the classical techniques for histopathology, stained with hematoxylin and eosin (H&E) and periodic acid-Schiff (PAS) for observation under optic microscope. Samples for transmission electron microscopy (TEM) were treated by the classic method. Samples stained with H&E showed arteriolar endothelial cell detachment, strong basophilic, enlarged and rounded nuclei. The metarterioles had disruption of the vascular wall and separation of the layers of the tunica media with endothelial macrocariosis. Venules showed the same damage as well as disrup tion of the wall vessel. PAS staining showed damage at the basal membrane of endothelial cells of all the vessels under study. TEM showed mitochondria in certain parts of the cytoplasm with increased electrodensity. Pinocytic citoplasmic vesicles showed variable size, with irregular distribution, with altered cell junctions. The experimental model using biopsy as the primary culture allowed the study of alterations in the vascular network induced by the toxins present in the venom. Thus, it can be considered a useful tool considering as it does not affect the animal's health.

Con el objeto de avalar la sensibilidad del veneno ofídico sobre la densa red vascular que irriga el pie equino, se analizaron los efectos in vitro de 50 μg de veneno, a través de biopsias de talones de 5 equinos de raza indefinida. Las muestras se incubaron en placas de cultivo celular conteniendo medio DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium). Un grupo de muestras operó como control y otro fue tratado con veneno, en estufa a 37ºC, con 5% de dióxido de carbono y 95% de humedad durante 24 y 48 h. Concluida la incubación, las muestras se fijaron en formaldehído bufferado y se procesaron con las técnicas clásicas para histopatología, siendo teñidas con HyE y PAS para su observación en microscopio óptico. Las muestras destinadas a microscopía electrónica de transmisión (MET) fueron tratadas por el método clásico. En los cortes coloreados (HyE) las arteriolas presentaron desprendimiento de células endoteliales, los núcleos fueron fuertemente basófilos, aumentados de tamaño y de forma redondeada. Las metaarteriolas presentaron disrupción de la pared vascular y separación de las capas que forman su túnica media, con macrocariosis endotelial. Las vénulas mostraron los mismos daños, manifestándose además la ruptura de la pared vascular. La técnica PAS permitió localizar daños a nivel de la membrana basal de las células endoteliales de todos los vasos sanguíneos estudiados. La MET reveló mitocondrias que resaltaban en puntos determinados del citoplasma, con aumento de la electrodensidad. Las vesículas pinocíticas citoplasmáticas mostraron tamaño variable, con distribución irregular; las uniones intercelulares estaban alteradas. El modelo experimental de biopsia, como cultivo primario, permitió el estudio de alteraciones en la red vascular inducidas por toxinas de veneno de serpiente, constituyendo una herramienta valiosa considerando que no afecta la salud del animal.

The aim of this work was to evaluate the pharmacological activities (citotoxicity, bactericidal, platelet aggregation) and the changes in the activity/stability of the isolated phospholipase A2 (PLA2) from Bothrops alternatus venom. In order to elucidate myotoxic and bactericidal activities, murine mioblast /miotubules (C2C12) and strains of Staphylococcus aureus (ATCC 25923) and Escherichia coli (ATCC 25922) were used, respectively. Also, normal mammary epithelial cell culture (NMuMG) and tumoral type (LM3) were tested for a possible role in oncological therapy. With the purpose of studying the inhibitory effect of the PLA2 on platelet aggregation, washed human platelet and thrombin as physiological inductor, were used. Finally, changes in the activity and stability of the isolated PLA2 at different temperatures (4-90ºC) by kinetic assays were recorded; while the enzyme was subjected to radial indirect hemolysis to evaluate the effect of different pH (2.5-10). The PLA2 presented dose-dependent inhibitory effect on thrombin-induced platelet aggregation. Also, it showed high structural stability when exposed to extreme conditions of temperature and pH during several hours, and catalytic activity remained almost unchanged. Nevertheless, this enzyme tested on different cells cultures did not induce cytotoxic (even at high doses) or bactericidal activities. These findings have a scientific value for toxicology since they expand the knowledge of the characterization (biological, biochemical and structural aspects) of one of the most abundant enzyme (PLA2 Ba SpII RP4) from the protein package of B. alternatus snake venom from the northeast of Argentina. Likewise, the confirmed safety and stability of this PLA2 strongly suggest that it could be proposed as an alternative immunogen for the antiserum production against Bothrops snake venom

El objetivo del trabajo fue evaluar actividades farmacológicas (citotóxica, bactericida, agregante plaquetaria) y factores que afectan la actividad/estabilidad de la fosfolipasa A2 (PLA2) aislada del veneno de Bothrops alternatus. Se utilizaron mioblastos/miotúbulos murinos (C2C12) y cepas bacterianas de Staphylococcus aureus (cepa ATCC 25923) y Escherichia coli (cepa ATCC 25922) para valorar respectivamente su acción miotóxica (in vitro) y bactericida, como así también líneas celulares epiteliales mamarias normales (NMuMG) y tumorales (LM3) para detectar su posible aplicación en terapia oncológica. Con el fin de evaluar la acción inhibitoria de la PLA2 aislada sobre la agregación plaquetaria se empleó plasma rico en plaquetas y trombina como inductor fisiológico. Por último, se registraron los cambios en la actividad y estabilidad de la PLA2 a diferentes temperaturas (4-90ºC) mediante ensayo cinético, en tanto que, por hemólisis radial indirecta se hizo lo mismo para evaluar efecto del pH (2,5-10). La PLA2 mostró una acción inhibitoria sobre la agregación plaquetaria dosis-dependiente. Presentó una alta estabilidad estructural al ser sometida a condiciones extremas de pH y temperatura durante varias horas, conservando la actividad catalítica prácticamente invariable. En cambio, cuando PLA2 fue evaluada sobre las diferentes líneas celulares, no produjo citotoxicidad (aún a dosis elevadas) ni efecto bactericida sobre las cepas utilizadas. Estos hallazgos amplían la caracterización de la enzima, una de las más abundantes del paquete proteico del veneno total de B. alternatus del nordeste argentino. A la vez, la inocuidad y estabilidad detectadas, permiten proponer a esta enzima como un inmunógeno alternativo en la producción de sueros antiofídicos.

Bothrops snake venoms have been proved toxic to a variety of cell types, in both in vivo and in vitro models. Studies on the pharmacological actions of Bothrops venoms from Argentina are relatively scarce and the direct action of the crude venoms has not been assessed using cell culture models. In this work, we investigated the cytotoxicity of crude venoms from B. alternatus and B. diporus in a skeletal muscle (C2C12) cell line, which is commonly used as a model for studying the myotoxic action of snake venom. Both venoms (1.25-50 µg/mL) induced an early and significant decrease in cell viability. The cytotoxic concentration 50 (CC50), determined three hours after exposure, revealed that B. diporus venom was significantly more cytotoxic (CC50: 2 µg/mL) than B. alternatus (CC50: 5.8 µg/mL). To investigate the cell death mechanism involved, myoblast cells were examined by phase contrast microscopy and after acridine orange and ethidium bromide fluorescence staining, respectively. Our data clearly demonstrated that an apoptotic mechanism mediated this cell line destruction. The current study aimed to provide new information on the cytotoxicity mechanisms of Argentine Bothrops snake venoms on a skeletal muscle cell line.